簡述腺病毒包裝

腺病毒概述

    腺病毒（Adenovirus，AdV）是一種無包膜的線性雙鏈DNA病毒，基因組長約35000 bp，理論上可編碼22~40個基因，兩端各有長約100~150bp的末端反向重復序列（ITR），在其左端ITR3，端為長約300bp的包裝信號（Ψ）。病毒顆粒直徑約80~110 nm，病毒衣殼有252個殼粒，呈規則的正二十面體面體結構，其中包括240個六聯體和12個位于正二十面體頂部的五聯體構成。

    腺病毒是一種非整合型雙鏈DNA病毒，在自然界中廣泛分布。盡管一些類型的腺病毒會引起人胃腸道、呼吸系統或眼部的急性感染，但是應用于基因治療研究的腺病毒是安全的，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害。

    利用基因工程手段將腺病毒基因組DNA改造成多種基因操作表達載體，目前常用的腺病毒包裝系統有：AdMax系統和AdEasyTM系統。

 

AdEasyTM包裝系統 

    AdEasyTM 包裝系統主要的特點是利用Cre/loxP系統在大腸桿菌（BJ5183）中完成外源基因插入腺病毒基因組的過程，獲得環狀的重組腺病毒基因組，并且具有在細菌中復制的必需元件。將重組腺病毒基因組酶切線性化后轉染HEK293細胞，避免了雙質粒共轉染得到重組腺病毒。

使用這個系統需要注意以下問題： 

（1） 要用能表達Cre重組酶的特定的大腸桿菌，建議建立菌種庫以免細菌發生變化；

（2） 由于重組是在細菌中發生的，微小的基因組變化不易發現； 

（3） 要獲得高品質的重組腺病毒毒種（高病毒產量、高目的基因表達）應挑選多個重組腺病毒質粒，分別轉染HEK293細胞，獲得多個重組病毒來篩選。

 

AdMax包裝系統 

    AdMax包裝系統是通過Cre/loxP 獲得重組病毒，這個過程發生在HEK293細胞中，從而避免在細菌中重組。將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質粒共轉染HEK293細胞，利用Cre/loxP系統的作用實現重組，產生重組腺病毒。這個系統有多種優勢，包括操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產率高、目的基因的表達水平高（因為mCMV啟動子比hCMV啟動子強若干倍）等。 

    與AdEasy系統相比，AdMax系統有一定的優勢：只需要3~4周就能完成從質粒構建到重組出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核細胞內重組出毒，保持了對腺病毒的生存壓力，有助于重組腺病毒的基因組的完整性；而AdEasy系統的出毒成功率只有18~34%（Stratagene公司新版的AdEasy XL系統成功率在94%左右），且在細菌（BJ5183）中完成病毒基因組重組，理論上，失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發生突變，病毒遺傳背景及活性可能會受到影響。

 

腺病毒載體有下列優點：

1、腺病毒的基因結構與功能研究的比較清楚；

2、可裝入基因的容量較大（8K）；

3、轉染范圍廣，轉染率較高，所有腺病毒載體均有轉染分裂期和非分裂期細胞的能力；

4、不整合到靶細胞基因組，無插入突變，無致癌性，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害；

5、可以復制出滴度高（可以達到1011 pfu/mL）、穩定性好、基因轉移效率高的病毒；

6、適用于在難以轉染的細胞中進行的RNA干擾、過表達特定基因或過表達特定microRNA研究和In Vivo實驗。 

 

腺病毒包裝

    重組腺病毒包裝是以Ad5血清型E1／E3缺陷型腺病毒DNA為架，在克隆，包裝，擴增等各部條件做了改進和優化，達到了克隆陽性率更高，質量更可靠，包裝穩定，出毒迅速，滴度高等效果。在此基礎上，還拓展了更廣泛的應用，可以提供各種帶報告基因的，帶不同標簽的腺病毒構建和包裝服務。 

    所包裝的腺病毒已成功應用于信號轉導，基因轉位，Co-IP，干細胞研究等科研實驗。并且可以完成較高難度的克隆構建，包括具有細胞毒性作用基因的腺病毒構建，在短時間內完成從原始質粒到病毒DNA的構建工作。

服務簡介：

提供各種RNA干擾和基因過表達的腺病毒包裝服務。

服務內容：

    是以帶熒光或不帶熒光的pEC3.1（+）為穿梭載體，pAd/BL-Dest為骨架載體進行的過表達病毒包裝；以pGensil為穿梭載體，pAd/BL-Dest為骨架載體進行干擾病毒的包裝。